1、安放：生物安全柜應放在遠離人員的活動、物品流動、門以及窗等可能會擾亂氣流的地方。在生物安全柜后面、左右各留 30 c m空間，上端留 30~ 50 c m 空間，以便于維修和更換濾膜。
2、操作：使用生物安全柜操作時，檢驗人員手和背的伸入或取出時應緩慢以保證氣流的完整性，并垂直于前端開口處。手或胳膊伸入柜中 1 m i n后開始操作以便于清潔皮膚表面。實驗所需器材應一次性放入生物安全柜。盡量減少或限制操作人員手在安全柜中的進出次數。
3、實驗材料的放置： A2生物安全柜前端開口處嚴禁被紙張、設備或其他物品覆蓋。物品放入安全柜時，表面要用70% 乙醇檫拭。柜內應該備有一塊浸過消毒液的毛巾，以便蘸取濺在柜的表面的傳染性液滴。實驗器材應按順序從清潔的排放到污染的。污染的實驗材料不應隨意拿出柜外，操作者的手也不應頻繁地進出安全柜。
4、操作和維護：大多數的 A2型生物安全柜設計成一天 24 h開機，調查發現連續開機有利于控制實驗室灰塵和粒子。 A2型生物安全柜不用時可以關閉，但A2型生物安全柜在使用時要保持實驗室空氣平衡，因此一天中若有數個操作過程，其間不應中斷運行。實驗開始前 5 m i n就應啟動安全柜，凈化局部空氣。使用中若出現任何故障均應及時向上級人員報告并請專職技術人員維修。
5、紫外線： A2型生物安全柜中不需要紫外線燈假如要用，每周要對燈管作清潔，除去塵埃，保證殺菌效果定期監測紫外線燈的輻射強度。要防止紫外線對眼睛和皮膚的灼傷。