厭氧培養(yǎng)箱的操作規(guī)程

（一）操作室厭氧環(huán)境形成：
1. 按使用要求放置好必要的附件和器具;
2. 通電源開照明燈，開溫控儀，調(diào)節(jié)所需溫度;
3. 操作室內(nèi)放入1000g鈀粒（封閉）和500g干燥劑，并放入美蘭指示紙（封閉）;
4. 關(guān)緊取樣室內(nèi)外門，并抽真空校驗(yàn);
5. 操作室內(nèi)*次置換（氮?dú)庵脫Q）：
A. 把乳膠手套套在觀察板法蘭圈上并扎緊
B. 接通氮?dú)膺M(jìn)氣路，打開氮?dú)饪刂崎y1，使手套鼓起，關(guān)閉閥門1，然后扎緊袋口;
6. 操作室第二次置換（氮?dú)庵脫Q）重復(fù)一次充氮過(guò)程，取樣室先抽真空，并注意隨時(shí)用腳踏開關(guān)開閉排氣。如此連續(xù)三次氮?dú)庵脫Q。
7. 操作室第四次置換（混合氣體置換）：
（混合氣體配比為N2 85%、H2 10%、CO2 5%）
A. 調(diào)換氣路打開混合氣閥3進(jìn)氣，充氣時(shí)取樣室先抽真空，并隨時(shí)用腳踏開關(guān)開閉排氣;
B. 關(guān)掉混合氣體閥3，并打開閥5，使混合氣體經(jīng)過(guò)流量計(jì)，調(diào)整流量計(jì)，流量為每分鐘10ml左右;
C. 混合氣體重復(fù)2-3次轉(zhuǎn)換，經(jīng)過(guò)上述過(guò)程，基本形成厭氧環(huán)境。
8. 操作室內(nèi)打開粑粒除氧劑，接通除氧催化器電源進(jìn)行催化除氧，一小時(shí)后打開美蘭指示紙觀察其變況，不變色為操作室內(nèi)達(dá)到厭氧環(huán)境;
9. 開紫外線滅菌燈，室內(nèi)進(jìn)行滅菌處理，滅菌時(shí)間按具體實(shí)驗(yàn)自定。
（二）菌種的置入和培養(yǎng)：
1. 檢查取樣室內(nèi)門并關(guān)緊;
2. 打開取樣室外門，將菌種放入取樣室后即關(guān)上外門;
3. 取樣室充氮置換三次過(guò)程：打開真空泵，先抽真空度500ml汞柱（66kPa）以上停，然后人工打開氮?dú)忾y2進(jìn)氣，使指針回復(fù)零位，關(guān)掉閥2。第二次重復(fù)操作一次。第三次操作時(shí)，使真空度500ml汞柱（66kPa）以上停，然后打開閥4進(jìn)混合氣，使指針回復(fù)零位，關(guān)掉閥4。取樣室充氮置換三次過(guò)程結(jié)束;
4. 如選定真空度較低就需要增加置換的次數(shù);
5. 取樣室外門開啟、關(guān)緊，再抽低真空度100ml汞柱（13kPa）檢驗(yàn);
6. 厭氧培養(yǎng)箱需要長(zhǎng)期連續(xù)使用的條件：
A. 每天在操作室內(nèi)打開美蘭指示紙觀察，如不正常就必須重新?lián)Q氣;
B. 要長(zhǎng)期連續(xù)輸入微量的混合氣體，使補(bǔ)進(jìn)的氮?dú)饽芎臀⒘康难踅Y(jié)合通過(guò)催化吸收，保證室內(nèi)厭氧狀態(tài)，補(bǔ)入混合氣流量選定為每分鐘10ml左右;
C. 連續(xù)培養(yǎng)運(yùn)行一天，更換一次除氧劑和干燥劑。
D. 操作室內(nèi)溫度可任意選擇和控制。
7. 混合氣瓶、氮?dú)馄枯敵鰤毫φ{(diào)整：調(diào)節(jié)減壓閥，使輸出壓力0.1Mpa左右。

厭氧培養(yǎng)箱的使用注意事項(xiàng)

1.儀器盡可能地安裝于空氣清凈、溫度變化較小的地方;
2.開機(jī)前應(yīng)全面熟悉和了解各組成配套儀器、儀表的使用說(shuō)明，掌握正確使用方法;
3.培養(yǎng)物放入必須是在操作室內(nèi)達(dá)到厭氧環(huán)境后放入;
4.如發(fā)生故障（停氣等原因）操作室內(nèi)仍可保持10小時(shí)厭氧狀態(tài)（超過(guò)10小時(shí)則根據(jù)需要把培養(yǎng)物取出另作處理）;
5.經(jīng)常注意氣路有無(wú)漏氣現(xiàn)象;
6.調(diào)換氣瓶時(shí)，注意要扎緊氣管，避免流入含氧氣體。
7. 真空泵按要求使用，定期檢查加油。

厭氧菌培養(yǎng)方法

厭氧菌在有氧的情況下不能生長(zhǎng)。要培養(yǎng)厭氧菌，必須創(chuàng)造一個(gè)無(wú)氧的環(huán)境。通常用培養(yǎng)基中加入還原劑，或用物理、化學(xué)方法去除環(huán)境中的游離氧，以降低氧化還原電勢(shì)。如皰肉培養(yǎng)基、硫基乙酸鈉培養(yǎng)基，牛心腦浸液培養(yǎng)基等。常用的厭氧培養(yǎng)方法有許多，可根據(jù)實(shí)際情況選用。
　　1．厭氧缸法接種好標(biāo)本的平板或液體培養(yǎng)基試管，可放入?yún)捬醺變?nèi)培養(yǎng)，厭氧缸是普通的干燥缸，用物理化學(xué)的方法使缸內(nèi)造成厭氧環(huán)境，從而將厭氧菌培養(yǎng)出來(lái)。
　　2．厭氧袋（Bio-bag）即在塑料袋內(nèi)造成厭氧環(huán)境來(lái)培養(yǎng)厭氧菌。塑料袋透明而不透氣，內(nèi)裝氣體發(fā)生管（有硼氫化鈉的碳酸氫鈉固體以及5%檸檬酸安瓿）、美蘭指示劑管、鈀催化劑管、干燥劑。放入已接種好的平板后，盡量擠出袋內(nèi)空氣，然后密封袋口。先折斷氣體發(fā)生管，后折斷美蘭指示劑管，命名袋內(nèi)在半小時(shí)內(nèi)造成無(wú)氣環(huán)境。如不突變表示袋內(nèi)已達(dá)厭氧狀態(tài)，可以孵育。
　　3．厭氧手套箱（Anaerobie glove box）即厭氧培養(yǎng)箱，是迄今為止上*的培養(yǎng)厭氧菌佳儀器之一。它是一個(gè)密閉的大型金屬箱，箱的前面有一個(gè)有機(jī)玻璃做的透明面板，板上裝有兩個(gè)手套，可通過(guò)手套在箱內(nèi)進(jìn)行操作，故名。箱側(cè)有一交換室，具有內(nèi)外二門，內(nèi)門通箱內(nèi)先關(guān)著。欲放物入箱，先打開外門，放入交換室，關(guān)上外門進(jìn)行抽氣和換氣（H2，CO2，N2）達(dá)到厭氧狀態(tài)，然后手伸入手套把交換室內(nèi)門打開，將物品移入箱內(nèi)，關(guān)上內(nèi)門。箱內(nèi)保持厭氧狀態(tài)，也是利用充氣中的氫在鈀的催化下和箱中錢殘余氧化合成水的原理。該箱可調(diào)節(jié)溫度，本身是孵箱或孵箱即附在其內(nèi)，還可放入解剖顯微鏡便于觀察厭氧菌菌落，這種厭氧箱適于作厭氧細(xì)菌的大量培養(yǎng)研究，大量培養(yǎng)基可放入作預(yù)還原和厭氧性無(wú)菌試驗(yàn)。金屬硬壁型厭氧箱的抽氣、充氣、厭氧環(huán)境和溫度等均系自動(dòng)調(diào)節(jié)。

    4.厭氧盒：原理同厭氧袋，有成品銷售。
    5.生物耗氧法：在一密閉的容器內(nèi)放以生物（多是植物），消耗氧氣，同時(shí)產(chǎn)生二氧化碳，供細(xì)?菌生長(zhǎng)用。我沒(méi)見(jiàn)過(guò)。
    6.焦性末食子酸法：在一潔凈的玻片上鋪上紗布或?yàn)V?紙，均勻撒上焦性末食子酸，然后再混入NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速將已接種細(xì)?菌的平板倒扣在上面，用融化的白蠟封邊，造成一個(gè)封閉空間。焦性末食子酸與堿反應(yīng)后耗氧。該法用于厭氧不嚴(yán)格的厭氧菌的培養(yǎng)，簡(jiǎn)單。如有梭狀芽孢桿菌。
    7.皰肉培養(yǎng)基：本身就是一個(gè)不需特殊設(shè)備的厭氧培養(yǎng)法。皰肉和肉?湯裝入大試?管，液面封凡士林，造成無(wú)氧環(huán)境。